H2O2誘導H9c2細胞凋亡中circNFIX表達及作用

　　[摘要]目的 探討環狀RNA NFIX(circNFIX)在H9c2細胞凋亡中的表達趨勢和功能。方法 將H9c2細胞應用200 μmol/L的H2O2孵育0、1、3、6、12 h，應用熒光定量PCR方法檢測H2O2誘導的H9c2細胞凋亡中circNFIX的表達趨勢。將H9c2細胞分為空白對照組(未轉染)、siRNA陰性對照組(轉染siRNA陰性對照組)和siRNA組(轉染siRNA)，應用熒光定量PCR方法檢測siRNA對circNFIX抑制效果。將H9c2細胞分為對照組(未轉染)、H2O2組(應用200 μmol/L H2O2孵育12 h)、H2O2+NC組(先轉染siRNA陰性對照，余處理同H2O2組)和H2O2+siRNA組(先轉染siRNA，余處理同H2O2組)，用TUNEL和Western blot方法檢測敲低circNFIX對H9c2細胞凋亡的影響。結果 circNFIX表達趨勢檢測顯示，隨著H2O2孵育時間的延長，circNFIX的表達水平逐漸下降(F=23.677，P<0.01);轉染siRNA可顯著降低circNFIX的表達水平(F=424.70，t=24.44～25.97，P<0.01)。TUNEL和Western blot檢測結果表明，轉染siRNA使TUNEL陽性細胞率和Bax/Bcl-2表達水平顯著降低(t=3.27～17.22，P<0.01)。結論 在H2O2誘導的H9c2細胞凋亡中circNFIX的表達水平減低，沉默circNFIX的表達抑制H9c2細胞凋亡。

　　[關鍵詞] RNA，環狀;過氧化氫;氧化性應激;細胞凋亡;心肌梗死

　　心肌梗死是一種缺血性心臟病，在全球有較高的發病率和死亡率[1-2]。隨著溶栓和經皮冠狀動脈介入治療的應用，心肌梗死病人的存活率顯著提高。然而，再灌注過程中超氧化物過載和鈣穩態失調使線粒體膜通透性轉換孔開放，進而引起心肌細胞凋亡[3]。凋亡的心肌細胞將被成纖維細胞代替，進而導致左心室的收縮功能障礙，最終發展為心力衰竭[4]。因此，亟需研究和明確心肌細胞凋亡的分子

　　機制。環狀RNA是一類閉合環狀的分子，具有保守性好、穩定性高、組織特異性和疾病發展階段特異性等特征[5]。環狀RNA有多種生物學功能，參與神經系統疾病和腫瘤等疾病的發病過程[6-7]。最近研究結果顯示，環狀RNA在心血管疾病的發生發展中發揮至關重要的作用[8]，而其在心肌細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究探討環狀RNA NFIX(circNFIX)在H9c2細胞凋亡中的變化趨勢和作用，為開發環狀RNA相關的診斷標志物和治療靶標提供實驗依據。

　　1 材料和方法

　　1.1 細胞與試劑

　　大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學院(上海)細胞庫;DMEM高糖培養基購于美國GIBCO公司;胎牛血清購于上海吉泰依科賽生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑、反轉錄試劑和SYBR green購于寶生物工程有限公司;Lipfectamine 3000購于賽默飛世爾科技公司;熒光定量PCR引物購于華大基因公司;siRNA和陰性對照(NC)購于上海吉瑪制藥技術有限公司;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司;RIPA裂解液(高強度)、PAGE凝膠快速制備試劑盒(125 g/L)、Omni-ECL超靈敏化學發光檢測試劑盒購于上海雅酶生物科技有限公司;Bax、Bcl-2抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司;GAPDH抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 細胞培養 大鼠心肌細胞H9c2培養于含體積分數0.05 CO2、37 ℃濕潤的細胞培養箱中，應用含有體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青霉素/鏈霉素混合液的DMEM高糖培養基進行培養。培養基每48 h更換1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

　　1.2.2 熒光定量PCR檢測環狀RNA和NFIX mRNA的表達 用Trizol法提取細胞總RNA，具體步驟參照Trizol試劑說明書。反轉錄按照反轉錄試劑說明書進行，反應條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃結束。熒光定量PCR的反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，用2-△△CT法計算circNFIX的表達水平。每個樣品設置3個復孔。引物序列見表1。1.2.3 候選環狀RNA表達檢測 選擇對數生長期的H9c2細胞，分為對照組(無藥物處理)、H2O2組(200 μmol/L H2O2孵育12 h)。收集細胞后，用1.2.2的方法檢測候選環狀RNA的表達水平。

　　1.2.4 circNFIX表達趨勢檢測 取對數生長期的H9c2細胞，分為0 h組(無藥物處理)、1 h組(應用200 μmol/L H2O2孵育1 h)、3 h組(200 μmol/L H2O2孵育3 h)、6 h組(200 μmol/L H2O2孵育6 h)、12 h組(應用200 μmol/L H2O2孵育12 h)。各組處理相應時間后收集細胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX的表達水平。

　　1.2.5 siRNA轉染效果檢測 取對數生長期的H9c2細胞分為空白對照組(未轉染)、siRNA陰性對照組(轉染NC)、siRNA組(轉染siRNA)。轉染步驟按照Lipfectamine 3000說明書進行，轉染24 h后收集各組細胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX和NFIX mRNA的表達水平。siRNA序列見表1。

　　NC組(先轉染NC，其余處理同H2O2組)、H2O2+siRNA組(先轉染siRNA，其余處理同H2O2組)。轉染24 h后，除對照組外均加入H2O2(終濃度為200 μmol/L)，繼續培養12 h。按照TUNEL檢測試劑盒說明書檢測各組TUNEL陽性細胞率。

　　1.2.7 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達

　　實驗分組及處理方法與1.2.6相同，培養結束以后加入RIPA裂解液提取總蛋白。各組樣品經SDS-PAGE蛋白質電泳后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗(Bax，1∶500;Bcl-2，1∶500;GAPDH，1∶5 000)

　　4 ℃孵育過夜，然后加入二抗(羊抗鼠二抗1∶5 000;羊抗兔二抗1∶5 000)于室溫孵育1 h，最后用ECL檢測試劑盒顯影。以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，結果以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值表示。

　　以上各指標檢測均重復3次。

　　1.3 統計學分析

　　使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結 果

　　2.1 環狀RNA的篩選和circNFIX的表達趨勢

　　應用熒光定量RCR檢測H9c2細胞凋亡前后候選環狀RNA的表達水平，結果顯示，circNFIX在H9c2細胞凋亡前后變化最顯著(t=17.535，P<0.01)。見表2。因此，選擇circNFIX做進一步研究。對circNFIX表達趨勢的檢測顯示，0、1、3、6、12 h組circNFIX相對表達量分別為1.00±0.01、0.92±0.06、0.84±0.04、0.79±0.05、0.62±0.02。隨著H2O2處理時間的延長，circNFIX的表達量逐漸減少(F=23.677，P<0.01)，其中12 h組較0 h組減少了48%(t=9.074，P<0.01)。表明在H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡中circNFIX的表達水平明顯下調。

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