傷寒桿菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法的研討

　　傷寒是由傷寒桿菌經(jīng)消化道侵入而引起的急性傳染病，遍布于世界各地，以熱帶、亞熱帶地區(qū)為多見，在我國(guó)和其他發(fā)展中國(guó)家仍是一種常見的傳染病.。傷寒桿菌經(jīng)口腔到消化道侵害小腸粘膜而入血，可造成傷寒桿菌菌血癥。傷寒病常稱“傷寒熱”， 其癥狀包括高燒，可達(dá)39°至40°C，其他癥狀有腹痛、嚴(yán)重腹瀉、頭痛、身體出現(xiàn)玫瑰色斑等。其中腸道出血或穿孔是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其傳染途徑為糞口途徑，傳染力很高。所以，傷寒的早期診斷十分重要。現(xiàn)對(duì)我中心使用的傷寒桿菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法研討如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料：選取送檢傷寒患者137例，其中男性77例，女性60例。年齡8—63歲，平均38歲。

　　1.2檢測(cè)方法：

　　1.2.1血清學(xué)檢測(cè)：肥達(dá)試驗(yàn)是臨床上常用于輔助診斷傷寒的傳統(tǒng)方法。其原理是用傷寒桿菌的菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及副傷寒甲、乙、丙菌液與稀釋的待測(cè)血清反應(yīng)，根據(jù)凝集效價(jià)判斷血清中有無(wú)傷寒桿菌的抗體。早期肥達(dá)試驗(yàn)需要急性期和大約間隔10天的康復(fù)期血清，兩份標(biāo)本之間抗O抗體或抗H抗體滴度升高4倍，更有診斷意義。傷寒桿菌的 O抗原與A群、B群沙門氏菌有部分相同抗原，與甲、乙兩種副傷寒桿菌有一定的交叉反應(yīng)，因此，肥達(dá)反應(yīng)診斷傷寒桿菌常出現(xiàn)假陽(yáng)性，特異性差，敏感性低，而且抗原抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集沉淀常需要20 h以上。

　　1.2.2免疫學(xué)檢測(cè)：①酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)(ELISA)：根據(jù)抗原或抗體特異性免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)，將已知的抗原或抗體結(jié)合在某種固相載體上，以辣根過氧化酶為指示劑，標(biāo)記在另一種抗原或抗體上，加入酶作用底物，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后，底物顯色，根據(jù)底物顯色的深淺定性或定量地檢測(cè)樣本中的抗體或抗原。②浸染試驗(yàn)(Dipstick assay)：又稱快速試紙法，是近些年發(fā)展起來(lái)的一種用膠體金作指示劑的快速診斷方法。基本原理是先將特異性的抗原或單克隆抗體固定于試紙條(硝酸纖維薄膜)的一端，檢測(cè)時(shí)將試紙條的另一端浸入待測(cè)樣品，由于毛細(xì)管作用，樣品液向前移動(dòng)，如待測(cè)樣品中含有相應(yīng)的抗體或抗原，則當(dāng)樣品液移至固定有抗原或抗體區(qū)時(shí)會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，在顯色系統(tǒng)的作用下，該區(qū)域出現(xiàn)一定的顏色。此法具有操作簡(jiǎn)單，不需任何儀器，20 min即能報(bào)告結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)查病時(shí)使用。浸染試驗(yàn)在特異性、敏感性、簡(jiǎn)單、快速方面優(yōu)于常規(guī)方法。

　　1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在模板DNA、引物和脫氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA鏈擴(kuò)增。它由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，是現(xiàn)階段檢測(cè)傷寒桿菌的最快速準(zhǔn)確的方法。①套式聚合酶鏈反應(yīng)：又稱二次PCR，在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第一輪PCR，然后再使用第一對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增。②一次PCR：只設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于PCR即完成檢測(cè)，但一次PCR檢測(cè)臨床血標(biāo)本容易受到血中大量存在的外周單個(gè)核細(xì)胞DNA非特異性擴(kuò)增的影響而使敏感性降低。③多重PCR：多重PCR是在同一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)完成多個(gè)不同基因擴(kuò)增的PCR。(4)免疫磁珠分離PCR：免疫磁珠就是將直徑0.05 μl～4 μl具有超順磁性的微粒表面經(jīng)化學(xué)修飾，使之與特異性抗體牢固結(jié)合，成為能與特異性抗原結(jié)合且有磁性的磁珠。

　　2結(jié)果

　　經(jīng)過我中心對(duì)傷寒桿菌檢測(cè)，132例患者得到了準(zhǔn)確的診斷，并且進(jìn)行了對(duì)癥治療;5例患者檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，仍需臨床進(jìn)一步觀察再送檢確診。

　　3討論

　　傷寒患者的診斷主要依據(jù)病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷，由于抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致血培養(yǎng)時(shí)傷寒桿菌的檢出率明顯降低，常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)患者血清中的特異性抗體，其特異性和敏感性均存在一定的問題，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。肥達(dá)氏試驗(yàn)早期陽(yáng)性率低，需到第3周、第4周才可達(dá)70%，實(shí)際上只有回顧性診斷價(jià)值，且假陽(yáng)性較高。免疫學(xué)檢測(cè)的方法具有靈敏度高、特異性好，反應(yīng)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易于判斷等特點(diǎn)，較肥達(dá)氏試驗(yàn)特異、敏感和快速，且價(jià)格低廉，一般實(shí)驗(yàn)室都能開展，易于普及推廣，適用于傷寒的早期診斷，具有較高的臨床價(jià)值。PCR技術(shù)檢測(cè)傷寒桿菌的方法敏感度更高，但是這類方法操作麻煩、對(duì)環(huán)境要求較高，且價(jià)格昂貴，很難普及。

　　檢測(cè)傷寒桿菌的方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，傷寒桿菌的檢測(cè)方法將向早期、快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異等方向發(fā)展，特別是免疫學(xué)檢測(cè)方法、PCR等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)用，會(huì)使傷寒桿菌的檢測(cè)方法日趨成熟，為臨床診斷提供更加快速準(zhǔn)確的科學(xué)診斷依據(jù)。