華癸根瘤菌urtB基因突變株的構建與共生固氮表型分析

　　尿素 ABC 轉運體透性酶亞基編碼基因 urtB 可能參與尿素代謝及支鏈氨基酸 轉運;本文旨在獲得實驗證據闡明 urtB 基因對華癸根瘤菌結瘤和固氮的影響，為深入研究 其功能機制提供一定的科學依據。

　　《工業微生物》介紹了工業微生物的特征與分類、微生物的營養與培養基、微生物的生長、微生物的代謝及調控、微生物的遺傳變異和育種以及微生物在食品、醫藥、環保、化工、能源、農業等方面的應用。

　　【方法】利用生物信息學分析 urtB 基因的結構特征及生物 學功能，通過熒光定量檢測 urtB 基因在自生和共生條件下的時空表達特征和啟動子原位表 達技術檢測 urtB 基因組織表達特征，采用插入突變構建 urtB 突變株，通過植物盆栽并結合 添加氮素處理，檢測與分析突變體的共生固氮表型變化。【結果】分析表明 urtB 基因對于氮 素轉運非常重要，在共生條件下的表達水平比自生培養條件下顯著上調表達;在成熟根瘤的 固氮區中大量表達;正確構建和篩選獲得了根瘤菌 urtB 突變株;接種 urtB 突變株與野生型 菌株 7653R 相比較，突變體根瘤發育異常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性顯著降 低;添加氮素可恢復其共生缺陷表型。【結論】華癸中慢生根瘤菌 urtB 基因可能通過影響根 瘤中氮轉運或同化，進而在根瘤發育與共生固氮中發揮重要作用。

　　根瘤菌具有多種多樣的物質運輸系統，能夠利用土壤和根際中的各種復合物[1–2]，如運 輸氨基酸的ABC轉運系統(ABC transporter)等。ABC型尿素轉運體是典型的ABC轉運系統， 包括 1 個錨定基底物結合蛋白、 2 個整合膜轉運亞基和 2 個 ATP 結合蛋白。該系統是由 urtABCDE基因簇編碼，其中urtA編碼脂質錨定尿素結合蛋白，urtB和urtC編碼整合膜蛋白， 由尿素透性酶的2個亞基組成，而urtD和urtE編碼ATP結合蛋白[3]。在藍細菌中，urtA、urtB 和 urtE的突變導致藍細菌減少尿素的吸收[4]。在缺乏氮素的條件下，ABC轉運體才會誘導表達 和合成，尿素的吸收能力提高3倍以上。但是在有氮培養基中，尿素轉運會停止或尿素吸 收也被阻礙。根瘤菌是一種能夠以類菌體形式存在于豆科植物根瘤中的革蘭氏陰性菌，一方 面將氮氣固定成植物所需氮源，另一方面利用植物所提供的碳源、氮源生存。有研究報道，

　　在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中，編碼氨基酸透性酶Aap和Bra基因雙突變后，由 于不能利用谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及天冬氨酸等氨基酸，根瘤菌生長受到明顯影響[5]。 另外，在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中發現作為ABC轉運體的psa透性酶不僅參與 Mn2+轉運，同時在系統毒性和抵御超氧化物及過氧化物中發揮重要作用[6]。特別值得關注的 是有研究報道在恥垢分枝桿菌中，在氮饑餓處理條件下，urtB基因上調表達19.17[7]。

　　華癸中慢生根瘤菌為我國特色的固氮資源，具有宿主專一性，其宿主為紫云英[8–9]。 7653R 基因組序列已注釋完成，根據本實驗室 RNA-sequence 和 Microarray 以及建立的共生 固氮子網絡，urtB、urtD 和 urtE 在共生固氮中均上調表達，其中 urtB 基因上調 16.8，其余 分別為 9.4 和 5.1[10]。本研究利用生物信息學分析 UrtB 蛋白的結構特征及生物學功能，通過 熒光定量和啟動子原位表達技術檢測 urtB 在自生和共生條件下的時空和組織表達特征，采 用插入失活突變技術構建 urtB 突變株，進行植物盆栽實驗鑒定其共生表型，以期獲得直接 證據闡明 urtB 基因在結瘤和固氮中的重要功能，為深入研究 urtB 基因的功能機制奠定工作 基礎和科學思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和質粒：本實驗所用供試菌株和質粒見表 1。

　　1.1.2 主要試劑及試劑盒：Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、2×Taq Master Mix、限制性內切酶、 T4-DNA 連接酶、M-MuLV 反轉錄酶、RNase 抑制劑購自 Ferments 公司和 TaKaRa 公司，瓊 脂糖凝膠電泳 Marker 購自東盛公司，PCR 產物凝膠回收試劑盒購自上海華舜(Watson)生物 公司，抗生素、培養基相關組分等分子生物學常規藥品及試劑均購自中國國藥集團本。研究 所用 PCR 引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，DNA 測序工作由天一輝遠公司和南 京金斯瑞生物科技有限公司完成。

　　1.1.3 引物：本實驗所用引物見表 2。

　　1.2 培養基和培養條件

　　大腸桿菌的培養采用 LB 培養基，在 37 °C 培養。7653R、突變株和定位菌株培養采用

　　TY 培養基，篩選突變株采用 AMS 培養基，在 28 °C 培養。

　　AMS 培養基(g/L)：MOPS 4.19，K2HPO4·3H2O 0.114，NaCl 0.2， MgSO4·7H2O 0.5，加

　　入 1 mL Solution A 和 2 mL Solution B 后，調節 pH 至 7，1´105 Pa 滅菌 30 min。Solution A (g/L)： EDTA-Na2 15，ZnSO4·7H2O 0.16，NaMoO4 0.2，H3BO3 0.25，MnSO4·4H2O 0.2，CuSO4·5H2O

　　0.02，CoCl2·4H2O 0.001，4 °C 長期保存。Solution B：CaCl2·2H2O 1.28 g (定容至 50 mL)， FeSO4·7H2O 0.33 g (定容至 50 mL)，隨后混勻為 100 mL，混合溶液現配現用，混合溶液 4 °C 貯存不超過 1 周。Solution C (g/L)：Thiamine hydrochloride 1，D-Pantothenic acid calcium salt Biotin 2，Biotin 0.001，過濾除菌，4 °C 保存。

　　1.3 urtB 突變株、啟動子表達定位菌株的構建及篩選

　　1.3.1 重組質粒的構建：以 7653R 菌株基因組 DNA 為模板，urtB-F 和 urtB-R 引物擴增同源 交換臂。PCR 反應條件：95 °C 5 min，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30 個循環;72 °C 10 min。 PCR 產物經 DNA 凝膠回收試劑盒回收后連接載體 pMD19-T (Simple)并轉化至 DH5α，PCR 驗證后將陽性克隆送至南京金斯瑞測序。抽提測序正確的陽性克隆質粒和載體 pK19mob 質

　　粒[11]。以 Hind III、Xba I 雙酶切陽性克隆質粒和 pK19mob，回收雙酶切后的目的片段、載 體，用 T4-DNA 連接酶連接后轉化至 S17-1。PCR 檢測陽性克隆并將正確的陽性克隆菌株命 名為 urtB-pK19mob。

　　1.3.2 啟動子表達定位菌株的構建：通過網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預測 urtB 基因啟動子序列，PCR 克隆目的片段并連接到 pRG960 載體[12]，將構建好的重組質粒 urtB-pRG960 和空載 pRG960 質粒分別通過電轉化到 7653R 感受態中。隨后將通過 GUS 染 色篩選得到的陽性菌株，分別命名為 urtB-promoter 和 pRG960-CK。隨后分別接種在紫云英 根部。之后分別收取 10、17、25、30 d 的根，經過簡單清洗后放到 GUS 染液中，37 °C 染 色 3 h 以上，隨后在普通光學顯微鏡和體式顯微鏡下觀察[13]。

　　GUS 染液：0.01 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.5 mol/L EDTA，0.001%Triton X-100，20%甲醇，

　　0.019 mol/L X-Gluc，0.05 mol/L PBS (pH=7.0)。

　　1.3.3 7653R△urtB 單交換突變株的篩選：以 urtB-pK19mob 為供體菌、7653R 為受體菌，進 行兩親本接合轉移。將 urtB-pK19mob 導入 7653R，基因通過同源重組交換將質粒整合到染 色體上，從而使靶基因失活。采用含有 Str+Neo 的 AMS 選擇性平板上篩選突變體[14]。將篩 選獲得的單菌落轉移到含有 Str+Neo 抗性的 TY 平板上，以載體 pK19mob 通用引物 M13-F 與酶切位點對應的目的基因篩選引物 D 進行 PCR 檢測，同時用野生型 7653R 基因組 DNA 為模板作對照[15]。

　　1.4 植物盆栽實驗及共生表型的測定

　　1.4.1 植物盆栽實驗：用 75%乙醇清洗紫云英種子表面 5 min，2% (V/V)的 NaClO 溶液表面消 毒 10 min，再用無菌水清洗 8–10 次，徹底洗去 NaClO 殘留，消毒后的種子吸水膨脹 4–8 h 后鋪于無菌素瓊脂平板表面，于 22 °C 培養箱(16 h 光照，8 h 黑暗)中培養約 2–3 d 催芽。催 芽后的種子播種含 Fahareus 無氮植物營養液的無菌沙盆，每組處理 5 株，約 3–5 d 植物幼苗 長出第一片真葉后，在根系接種 1 mL (OD600= 0.5)相對應的根瘤菌懸液，光照培養箱培養 30 d。另外以 Fahareus 無氮植物營養液為基本營養液和 NH4NO3 配制所需營養液的無菌雙層沙 盆。

　　1.4.2 共生表型的測定：觀察植株長勢并測定地上部分鮮重、瘤數、瘤重、固氮酶活(乙炔還 原法)測定[17]。

　　1.5 目標基因在自生和共生條件下的熒光定量表達檢測 分別抽提自生條件下培養的華癸中慢生根瘤菌 7653R、接種 7653R 的紫云英 9、12、14、

　　18、21、25、30、45、50 d 根瘤的 RNA，純化后測定 RNA 濃度，均調至 2000 ng，并進行 反轉錄。RT-PCR 程序：42 °C 1 h;72 °C 10 min。

　　1.6 熒光定量 PCR

　　先用普通 PCR 將內參基因亮度調一致，然后用目標基因進行擴增，若條帶單一，大小 正確，再進行熒光定量 PCR 檢測，內參基因為 rnpB。Real-time qPCR 程序：95 °C 5 min; 95 °C 30 s;60 °C 20 s，72 °C 20 s，40 個循環。信號檢測染料使用 SYBR Green，分析相對表達量采用 2–△△C

　　1.7 目標基因的生物信息學分析

　　利用 NCBI 網站根據目標基因的 ID 名稱查找編碼蛋白質的序列及名稱，然后通過 NCBI Conserved Domain Search 網頁分析靶蛋白的保守結構域，根據保守結構域預測靶蛋白的功 能;將蛋白序列通過 BLASTp 比對查找同源蛋白，挑選不同物種的同源蛋白序列，使用 DNAMAN 軟件進行蛋白同源比對分析，使用 Clustal X 和 MEGA7 軟件的鄰位相接法系統 (bootstrap N-J Tree)來構建系統發育樹。

　　2 結果和分析

　　2.1 urtB 基因編碼蛋白的結構域和功能分析 基于前期工作基礎，我們分析了系列目標基因在共生根瘤中的表達變化，發現 urtB、urtD

　　和 urtE 等在共生固氮條件下均顯著上調表達，其中 urtB 上調 16.8 倍，urtD 上調 9.4 倍，urtE 上調 5.1 倍[10–20]。這表明 ABC 型尿素轉運體在共生固氮中應該發揮重要功能。urtB 基因全 長 1614 bp，編碼 537 個氨基酸，分子量預期大小為 56.6 kDa。我們進一步在 NCBI 上分析 了 urtB 基因編碼蛋白的保守結構域(圖 1)。

　　通過基本的生物信息分析發現，UrtB 蛋白氨基酸序列包含一個 TM-ABC transporter signature motif 和 urea_trans_UrtB 結構域，含有該結構域的蛋白超家族參與尿素的代謝和循環。藍細 菌中的研究結果表明該基因缺失造成高親和力尿素轉運的缺失[4]。UrtB 在苜蓿根瘤菌 2011 中的同源基因蛋白是 SMb20604，在苜蓿根瘤中該基因在侵染區、過渡區和固氮區均有表達 其中在侵染區和固氮區的表達量最高。因此，以上分析提示該類基因在根瘤固氮中具有重要 作用。