我國是世界上最大的蛋品生產(chǎn)國，但目前蛋品加工水平卻較低、技術(shù)陳舊，同時由于某些飲食習(xí)慣和行業(yè)的特殊需求，對蛋黃的需求量較大，比如做月餅、蛋黃派等，其副產(chǎn)物——蛋清常被低值利用甚至被當(dāng)成廢棄物丟棄，也污染了環(huán)境[1]。蛋清蛋白是食物中最理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其氨基酸組成非常適合人體需要，利用率高達(dá)99.6%，但由于其受熱易凝固等性質(zhì)也使其應(yīng)用受到了一定程度的限制[2]。而將其酶法改性后卻能得到具有多種生理活性的蛋清肽(eggwhitepeptides，EWP)，使其附加值大大提高。鈣是人體必需的常量元素，參與機體多種生理活動。人類缺鈣是全球性的營養(yǎng)問題，可導(dǎo)致人體產(chǎn)生骨質(zhì)疏松、佝僂癥等多種疾病，甚至對心血管也會產(chǎn)生極大的負(fù)作用，然而人們卻一直找不到有效、經(jīng)濟(jì)的鈣源補充[3]。小肽能與鈣離子形成可溶性螯合物，完整地被轉(zhuǎn)運吸收，需要時又能有效地將鈣離子釋放出來，同時還能補充一定的氨基酸[4]。與其他補鈣劑相比，它更易被快速吸收，穩(wěn)定性更好。

國內(nèi)外已有不少學(xué)者研究了肽-鈣配合物、氨基酸-鈣螯合物的補鈣作用。Choi等[5]研究了卵黃高磷蛋白磷酸肽的鈣結(jié)合能力，實驗組的飼料中加入0.125%～0.5%卵黃高磷蛋白磷酸肽-鈣配合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的SD大鼠的骨密度和骨礦物質(zhì)含量較空白組顯著提高，表明卵黃高磷蛋白磷酸肽-鈣配合物能夠有效提高鈣的生物利用率，促進(jìn)鈣質(zhì)沉積于骨骼。菅景穎[6]對膠原多肽-鈣配合物的研究表明，其無論是在對骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防，還是在促進(jìn)骨骼生長和壯骨方面，效果均十分理想，效果優(yōu)于葡萄糖酸鈣和CaCO3。但目前尚未見有研究蛋清肽-鈣配合物(EWP-Ca)補鈣功能的報道。本實驗首次對EWP-Ca促鈣吸收功能進(jìn)行研究，通過在最優(yōu)條件下制得的EWP-Ca，飼喂缺鈣大鼠一個月，研究該配合物對處于生長期的大鼠的骨骼發(fā)育的影響，為該產(chǎn)品在今后進(jìn)一步用于人體補鈣提供一定的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

Wistar大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量(80±5)g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心,許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。按照文獻(xiàn)[7]的方法制備EWP-Ca，再經(jīng)截留分子質(zhì)量為5kD的超濾膜處理，收集膜透過級分，凍干，其鈣結(jié)合率為16.45%。CaCO3(優(yōu)級純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清鈣試劑盒、血清磷試劑盒、血清堿性磷酸酶試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2儀器與設(shè)備

AA-6300C原子吸收分光光度儀日本島津公司；XR-36雙能X線骨密度儀美國Norland公司；5810/R低溫高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；Ⅰ型游標(biāo)卡尺南京三豐機電有限公司。

1.3方法

1.3.1自制缺鈣飼料和普通飼料

實驗為建立缺鈣模型，自制缺鈣飼料，配方見表1。經(jīng)原子吸收法測定，其中鈣含量為0.01%。為了保證基礎(chǔ)營養(yǎng)成分的一致，同時自制了鈣含量0.35%的普通飼料，其中鈣來源于添加的CaCO3。

1.3.2EWP-Ca的制備

雙酶法制備蛋清肽參照文獻(xiàn)[7]方法，將上清液過截留分子質(zhì)量為5kD的超濾膜，濾液冷凍干燥得蛋清肽粉，配制成4g/100mL的初始肽液，在55℃、pH9.5、肽粉與CaCl2質(zhì)量比2.5:1的條件下，與0.5g/mLCaCl2溶液混合攪拌20min，經(jīng)過乙醇沉淀、離心分離及冷凍干燥后，制得EWP-Ca。

1.3.3指標(biāo)測定

鈣含量測定參照文獻(xiàn)[8]所述方法進(jìn)行；粗蛋白含量測定：采用微量凱式定氮法[9]；多糖含量測定：參照GB/T9695.31—2008《肉制品總糖含量測定》方法。

1.3.4分組與給藥方式

大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機分為6組，每組10只，分別為普通組、缺鈣模型組、CaCO3組和EWP-Ca低、中、高劑量組。各組動物喂以對應(yīng)的飼料，普通組和缺鈣模型組灌胃去離子水。EWP-Ca低、中、高劑量組，分別為每天灌胃不同劑量的EWP-Ca；CaCO3組每天灌胃CaCO3，折算鈣元素含量與EWP-Ca高劑量組相同。灌胃量為0.3mL。每兩天稱量一次動物體質(zhì)量。具體方法見表2。實驗至30d后，將動物摘眼球處死，收集血液，4℃、104r/min離心15min，取出血清。同時取出兩側(cè)股骨，分別放入烘箱中60℃條件下烘干至恒質(zhì)量。

1.3.5血清鈣、磷及堿性磷酸酶測定

參照南京建成生物工程研究所試劑盒方法測定。

1.3.6股骨干質(zhì)量、長度、直徑、骨密度及骨鈣含量的測定

取出大鼠左側(cè)股骨，用游標(biāo)卡尺精確測定長度、股骨中心直徑。采用NorlandXR-36雙能X線骨密度儀測定左股骨骨密度。取右側(cè)烘干后的股骨稱量股骨干質(zhì)量，再經(jīng)混和酸(硝酸、高氯酸體積比4:1)濕法消化后，以0.5%的氯化鍶溶液定容，采用原子吸收分光光度計測定骨鈣含量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

運用SPSS統(tǒng)計軟件包進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1大鼠飼料組分分析

大鼠對各種營養(yǎng)物含量的需求為蛋白質(zhì)＞20%，碳水化合物＞60%，鈣元素約0.5%。由表3可知，普通飼料組分測定結(jié)果基本可滿足大鼠正常生長的需要，不會產(chǎn)生營養(yǎng)缺乏病；缺鈣飼料則要求鈣含量＜0.1%，故也符合要求。

2.2蛋清肽-鈣配合物對大鼠血清指標(biāo)的影響

由表4可知，缺鈣模型組大鼠血清鈣含量極顯著低于其余5組(P＜0.01)，說明通過飼喂自制的缺鈣飼料來構(gòu)造缺鈣模型是成功的；各組之間血清磷含量差異均不顯著(P＞0.05)；除低劑量EWP-Ca外，其余4組的血清堿性磷酸酶(AKP)的活力均極顯著低于缺鈣模型組(P＜0.01)，且高劑量EWP-Ca組明顯低于相同鈣劑量的CaCO3組，兩者之間差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。血清AKP是由成骨細(xì)胞釋放，在肝臟功能正常的情況下，血清AKP水平能較好地反映成骨細(xì)胞的活動狀況，是骨形成的特異性指標(biāo)。血清中的AKP主要來自肝臟與骨胳，當(dāng)處于一些疾病狀態(tài)下AKP會釋放進(jìn)入血清。缺鈣模型組的血清AKP最高，說明該組動物由于缺鈣嚴(yán)重，出現(xiàn)了高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，因此AKP值不斷上升，這與劉忠厚[10]研究骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的高骨轉(zhuǎn)換率時，AKP明顯升高的結(jié)論相一致。