非細(xì)胞型HBOCs的抗氧化研究

維持Hb的還原狀態(tài)是保證其能夠攜帶氧的前提條件，而維持其還原狀態(tài)則有賴于Hb所處環(huán)境中有較高濃度的還原劑，較低濃度的氧化劑。石曉東等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行微孔膜分離時(shí)，MetHb增加不多；但去除超氧化物歧化酶(SOD)等其他紅細(xì)胞蛋白后再進(jìn)行超濾膜濃縮Hb，出現(xiàn)較多的MetHb，說明抗氧化劑的能有效地降低MetHb的生成。在Hb溶液中和制備Hb的超濾過程中，谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亞硫酸鈉、維生素C都能保護(hù)Hb免被氧化[2]。無基質(zhì)Hb（Stromafleehemoglobin,SFH）由于缺乏正常紅細(xì)胞所具有的還原酶系（如SOD、過氧化氫酶CAT、MetHb還原酶等），Hb內(nèi)的Fe2+容易氧化成Fe3+形成MetHb而失去攜氧能力，并且還可產(chǎn)生自由基，尤其是在組織缺血再灌注時(shí)，可發(fā)生自由基的級聯(lián)反應(yīng)，造成組織的過氧化損傷；同時(shí)Hb釋放的鐵離子能促進(jìn)細(xì)菌的生長，可能引起膿毒癥等。因此，除了其他副作用和缺陷外，單從抗氧化的角度，SFH就不是理想的氧載體。

第一代HBOCs的研究主要是對Hb的化學(xué)修飾，主要包括Hb的分子內(nèi)修飾（形成分子內(nèi)交聯(lián)Hb）、表面修飾（形成共軛Hb）、分子內(nèi)與分子間的雙重修飾（形成聚合Hb）等[3]。其主要目的穩(wěn)定Hb的四聚體結(jié)構(gòu)，增加分子量，延長半衰期；升高P50，降低Hb與氧的親和力，利于組織細(xì)胞獲得更多的氧。然而，這類修飾并沒有提高Hb的抗氧化能力[4]，有些修飾反而促進(jìn)了MetHb的形成。如多聚交聯(lián)Hb的自氧化作用比未聚合交聯(lián)Hb顯著增強(qiáng)[5]；Sprung等[6]對55例手術(shù)患者在術(shù)中使用了不同劑量的HBOC-201(HemopureTM，Biopure公司生產(chǎn)的超純化的戊二醛多聚牛Hb電解質(zhì)平衡溶液)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后血漿MetHb呈劑量依賴性升高。O′HaraJF等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HemAssistTM（DCLHb）在儲存過程中，會(huì)隨著時(shí)間和溫度的增加，MetHb含量也明顯增加。對大量失血患者使用大劑量的DCLHb治療過程中發(fā)現(xiàn)血漿MetHb有不同程度的增加。盡管在這些研究中MetHb的增加在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和初期臨床試驗(yàn)中并沒有引起明顯的并發(fā)癥，但是對患有嚴(yán)重疾病，尤其是危重病如多器官功能障礙綜合癥、缺血再灌注損傷等患者，由于復(fù)雜的病理生理環(huán)境（如自由基增加，過氧化狀態(tài)，炎性介質(zhì)的釋放等）可能會(huì)加重病情或引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。

為了克服非細(xì)胞型HBOCs的自氧化缺陷，國內(nèi)外學(xué)者開始了第二代HBOCs的研發(fā)，即在多聚的血紅蛋白上交聯(lián)抗氧化劑如SOD、CAT、硝基氧、GSH、水溶性維生素E類似物等，使多聚Hb具有抗氧化性。Chang等利用研發(fā)的交聯(lián)SOD和CAT的聚合牛Hb（即PolyHb-SOD-CAT）對大鼠進(jìn)行缺血再灌注研究，發(fā)現(xiàn)PolyHb-SOD-CAT對大鼠肝、腎再灌注具有較強(qiáng)的抗氧化性[8,9]。Powanda等[10]利用大鼠球形腦缺血再灌注模型，觀察PolyHb-SOD-CAT的效果時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯的由氧自由基引發(fā)的再灌注損傷。我國楊懿銘等[11]采用戊二醛交聯(lián)法制備的抗氧化酶交聯(lián)的多聚Hb即PolyHb-SOD-CAT，測定不同溫度、時(shí)間保存下制品MetHb的變化，發(fā)現(xiàn)在4℃、24℃不同保存時(shí)間均呈自氧化穩(wěn)定，37℃、8小時(shí)顯示比多聚Hb有更強(qiáng)的自氧化穩(wěn)定性。說明交聯(lián)了SOD、CAT的多聚Hb具有了抗氧化性，在一定程度上減輕了活性氧自由基的產(chǎn)生,并能抑制多聚Hb制備過程中MetHb的形成,減少Fe3+及血紅素的析出。

以基因重組方法生產(chǎn)重組人Hb也是開發(fā)HBOCs的重要途徑，Hoffman等[12]將Hb的α和β基因構(gòu)建于同一表達(dá)載體，使α和β亞基在表達(dá)過程中即形成α2β2四聚體。由此可以想象，將抗氧化劑如MetHb還原酶、SOD和（或）CAT的基因與Hb的α和β基因構(gòu)建于同一表達(dá)載體，將可能生產(chǎn)出具有較強(qiáng)抗氧化性的Hb。也有研究發(fā)現(xiàn)，人Hb的α鏈上酪氨酸Y-42位是血紅素產(chǎn)生自由基的關(guān)鍵部位[13]，可以用無反應(yīng)活性的氨基酸取代Y-42位，認(rèn)為可以有效減少氧自由基的產(chǎn)生。因此，重組蛋白工程也是阻止HBOCs被氧化的有效途徑之一。

細(xì)胞型HBOCs的抗氧化研究

細(xì)胞型HBOCs是第三代血液代用品，主要特點(diǎn)是在Hb的外面用膜包覆，在結(jié)構(gòu)上接近紅細(xì)胞。早期的人工紅細(xì)胞是用一薄層有機(jī)酯包裹Hb、2，3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）、CAT和碳酸酐酶等。由于半衰期非常短、毒性大，又發(fā)展了用脂質(zhì)體為材料的亞微米人工紅細(xì)胞——脂質(zhì)體包埋Hb，并進(jìn)行了脂質(zhì)體表面修飾，雖然半衰期明顯延長，但MetHb的生成明顯增加。為了減少M(fèi)etHb生成以及其他副作用的產(chǎn)生，國內(nèi)外學(xué)者把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到生物降解納米材料包裹Hb的研發(fā)上。如聚交酯或聚乙醇酸交酯包裹Hb的納米級人工紅細(xì)胞，同時(shí)加入MetHb還原酶等酶類。這種生物可降解聚合物包膜可以使外部的葡萄糖和還原酶進(jìn)入微囊，而反應(yīng)產(chǎn)物也可透過此膜到囊外，從而避免反應(yīng)產(chǎn)物對還原反應(yīng)的抑制。Chang等[14]曾研究出聚乙烯乙二醇-聚交酯包囊包裹了紅細(xì)胞內(nèi)全部酶類的納米級人工紅細(xì)胞，輸注大鼠后血漿中半衰期為24.2小時(shí)，在人體有可能達(dá)到41.5小時(shí)；如果將其重懸于100mg/dl葡萄糖和0.02mM輔酶I(NADH)的乳酸林格液中，5小時(shí)后MetHb含量下降到1.5%，說明該包囊還能利用外液體環(huán)境中的還原劑有效地還原MetHb。SakaiH等[15]研制出的聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體包被的血紅蛋白微囊，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前的安全和效能評估。我國章曉蘭等[16]研究制備了表面孔徑可調(diào)的載牛血紅蛋白(bovinehemoglobin，BHb)納米微球型血液代用品，并且建立了一套兩步還原及過程優(yōu)化的非酶還原系統(tǒng)控制其中的MetHb含量。通過兩步還原及過程控制，MetHb在原料中的含量從90％以上降為1.25％，接近天然血液中MetHb含量，具備攜氧／釋氧功能。同時(shí)，由于微球的膜是可調(diào)孔徑的多孔結(jié)構(gòu)，進(jìn)入體內(nèi)后，血漿中的還原成分可透過微球膜進(jìn)入其中，可進(jìn)一步抑制MetHb的生成。這為建立人工紅細(xì)胞內(nèi)的還原酶體系奠定了基礎(chǔ)。

近年來，利用生物降解聚合物作為Hb載體的研究越來越受到了國內(nèi)外學(xué)者的青睞。國際上如日本Tsuchida小組和美國Rudolph小組等，在利用生物可降解的聚乳酸（PLA）、聚乳酸乙醇酸（PLGA）等高分子材料開發(fā)包含Hb、紅細(xì)胞各種酶類如SOD、MetHb還原酶在內(nèi)的納米微囊。我國中國科學(xué)院黃宇彬等工作者利用可降解納米膠束（膠囊）技術(shù)合成了兩親性的PEG-MPC-PLA嵌段共聚物，在其膠束的憎水核的表面利用click反應(yīng)鍵合了Hb，實(shí)驗(yàn)證明該聚合物不僅具有良好的氧合和解離功能，而且表面的PEG鏈段在水溶液中能自由伸展，可以有效地防止Hb被氧化和免疫系統(tǒng)攻擊。同時(shí)，他們還合成了兩親性氨基酸共聚物聚賴氨酸-聚苯丙氨酸（PLL-b-PPA)，可以在水中形成一種包裹Hb的微米級囊泡。這不僅可以保證Hb的攜氧功能，而且可以有效地保護(hù)Hb免受環(huán)境中氧化劑的攻擊[17,18,19]，也可以將MetHb還原酶等酶類包裹其中，確保Hb不被氧化。王翔等[20,21]基于紅細(xì)胞力學(xué)特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與攜氧功能的關(guān)系,研發(fā)了一種與天然紅細(xì)胞在形態(tài)、功能、結(jié)構(gòu)上相似的人工紅細(xì)胞，重建的人工紅細(xì)胞具有正常紅細(xì)胞的攜氧和釋氧能力，并包含了正常紅細(xì)胞具有的還原酶類，能夠有效地防止Hb被氧化。