左歸丸對(duì)去勢(shì)大鼠鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)蛋白的影響

　　〔摘要〕 目的 探討左歸丸去勢(shì)大鼠骨密度和骨、腎組織中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)蛋白的影響。方法 選取48只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，模型組，西藥組，中藥低、高劑量組。除假手術(shù)組和正常組，其余組切除大鼠卵巢，造模成功后3個(gè)月進(jìn)行各組干預(yù)。3個(gè)月后處死大鼠，檢測(cè)大鼠骨密度(BMD);Western blotting法檢測(cè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路(腎組織)蛋白表達(dá);免疫組化檢測(cè)去勢(shì)大鼠骨組織中新型上皮鈣通道5(TRPV5)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，左歸丸高劑量組與西藥組大鼠骨密度均有改善(P<0.05);與假手術(shù)組比較，模型組各蛋白表達(dá)均有不同程度下降(P<0.01，P<0.05);尼爾雌醇和左歸丸均能不同程度上調(diào)去勢(shì)大鼠腎組織中TRPV5蛋白、鈉鈣交換器(NCX1)蛋白、鈣結(jié)合蛋白-D28K(CaBP-D28K)和細(xì)胞膜鈣汞(PMCA1b)蛋白表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01);免疫組化顯示模型組較假手術(shù)組的TRPV5蛋白表達(dá)率增加(P<0.05)，而西藥組和中藥高、低劑量組較模型組蛋白表達(dá)率均下降(P<0.05)。結(jié)論 左歸丸可通過(guò)上調(diào)腎鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)和降低大鼠破骨細(xì)胞中TRPV5蛋白的表達(dá)，而發(fā)揮骨質(zhì)疏松癥治療作用，腎、骨組織中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相關(guān)蛋白可能成為骨質(zhì)疏松癥治療的新方向、新靶點(diǎn)。

　　〔關(guān)鍵詞〕 左歸丸;去勢(shì)大鼠;鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路

　　《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(文摘版)醫(yī)藥衛(wèi)生》簡(jiǎn)稱《醫(yī)藥衛(wèi)生》是經(jīng)國(guó)家新聞出版廣電總局2009年4月8日批準(zhǔn)的國(guó)家級(jí)電子學(xué)術(shù)教育期刊。

　　近幾年骨質(zhì)疏松的發(fā)病人數(shù)在我國(guó)已經(jīng)明顯上升，在60～70歲階段，約33%的女性和20%的男性患有該疾病，骨質(zhì)疏松流行病對(duì)中老年人的生命安全、身體健康等形成一定的危害與威脅[1]。到2050年中國(guó)骨質(zhì)疏松癥或骨密度低的患者將達(dá)到2.12億[2]，骨質(zhì)疏松癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨，腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的始動(dòng)病機(jī)[3-4]，腎精盛衰直接決定機(jī)體生、長(zhǎng)、壯、老、已的生命活動(dòng)狀態(tài)。而骨的生長(zhǎng)發(fā)育狀況也直接與腎精盛衰密切相關(guān)。左歸丸是滋陰補(bǔ)腎、填精益髓的名方，實(shí)驗(yàn)研究證明，左歸丸具有類雌激素作用，能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞的活性，維持二者的動(dòng)態(tài)平衡，為中醫(yī)“腎主骨”理論提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[5-6]。瞬時(shí)性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)家族成員新型上皮鈣通道5(TRPV5)是已知TRP中鈣離子高選擇性通道[7]，它在機(jī)體鈣離子跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)整個(gè)機(jī)體的鈣平衡。其介導(dǎo)的腎鈣及骨鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與骨質(zhì)疏松癥的鈣代謝紊亂有著密切的聯(lián)系。本研究擬基于TRPV5介導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路(腎組織、骨組織)探討補(bǔ)腎經(jīng)典方劑左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的療效及作用機(jī)制。

　　1 材料

　　1.1 動(dòng)物與藥物

　　6月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠48只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療合格證號(hào)43004700022760。左歸丸配方：熟地黃24 g，山藥12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟絲子12 g，鹿膠12 g，龜膠12 g(由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供)，將藥物水煎2次，合并濾液并濃縮致0.48 g(生藥量)/mL(相當(dāng)臨床等效劑量)、1.92 g(生藥量)/mL濃度的藥液(相當(dāng)于臨床4倍量)。尼爾雌醇(購(gòu)自上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司新華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31021647，規(guī)格2 mg/片)。

　　1.2 主要試劑

　　TRPV5(貨號(hào)17322-1-ap)、CaBP-D28k(貨號(hào)14479-1-ap)、NCX1(貨號(hào)55075-1-ap)兔抗體均由(美國(guó))proteintech公司提供;β-actin鼠抗體(貨號(hào)60008-1-Ig)、PMCAIb(貨號(hào)ab190355)兔抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;中性樹膠購(gòu)自Sigma公司;蘇木素、PBS(PH7.2-7.6)和枸櫞酸鹽緩沖液購(gòu)自Wellbio公司;二步法試劑盒、DBA試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。

　　1.3 主要儀器

　　電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司);蛋白酶抑制劑(德國(guó)Merck公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(中國(guó)深圳黑馬公司);全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)和多功能酶標(biāo)分析儀(匯松公司);電泳槽(中國(guó)北京六一公司);轉(zhuǎn)膜儀(中國(guó)北京六一公司);包埋機(jī)(常州中威電子儀器公司)、顯微鏡(Motic公司)。

　　2 方法

　　2.1 分組

　　將大鼠隨機(jī)分成左歸丸高劑量組、左歸丸低劑量組、西藥組、模型組、正常組及假手術(shù)組，每組8只。除假手術(shù)組和正常組，其余組均切除大鼠雙側(cè)卵巢復(fù)制絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。

　　2.2 造模

　　造模方法參照文獻(xiàn)[8]，10%水合氯醛溶液對(duì)大鼠按0.33 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射進(jìn)行麻醉，將假手術(shù)組大鼠背部切開，進(jìn)入腹腔，將卵巢找到，從其旁將一定量的脂肪(1 g左右)剪除。將切除卵巢組大鼠距脊柱外側(cè)約1 cm與背部腋中線交叉部位的皮膚切開，腹腔打開，行兩側(cè)卵巢摘除術(shù)。傷口消毒7 d，觀察傷口愈合情況。

　　2.3 給藥劑量及方法

　　6組大鼠自由攝食、飲水，術(shù)后3月行活體骨密度(bone mineral density， BMD)檢測(cè)驗(yàn)證模型復(fù)制成功，進(jìn)行分組治療干預(yù)。按70 kg的成人一天服用左歸丸的生藥量為105 g計(jì)算，人的給藥量為1.5 g/(kg·d)，按照動(dòng)物與人體表面積換算法，大鼠的臨床等效給藥量應(yīng)為9.45 g/(kg·d)。每組大鼠的給藥體積均為20 mL/(kg·d)，根據(jù)大鼠每日給藥量與給藥體積，制備左歸丸低濃度煎劑為0.48 g生藥/mL(相當(dāng)于臨床等效給藥量)、左歸丸高濃度煎劑1.92 g生藥/mL(相當(dāng)于臨床4倍量)。

　　中藥低劑量組給予左歸丸低濃度煎劑(0.48 g/mL)，體積為20 mL/(kg·d);中藥高劑量組給予左歸丸高濃度煎劑(1.92 g/mL)，體積為20 mL/(kg·d);西藥組給予尼爾雌醇1 mL/(kg·d)灌胃，使用前配成混懸液(濃度為0.167 mg/mL)，1次/周，其余時(shí)間予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃;假手術(shù)組和模型組的大鼠給予體20 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃飼服。以上干預(yù)治療均持續(xù)3個(gè)月。

　　2.4 腎樣品和股骨頭的標(biāo)本制備

　　腎樣品制備：剪取大鼠0.25 g腎組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入200 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見(jiàn)組織塊，以備Western Blot法檢測(cè)大鼠腎組織中TRPV5介導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

　　股骨樣品制備：將大鼠肌肉筋膜(附著在右后肢股骨)剔掉，以便進(jìn)行大鼠樣本骨密度檢測(cè)。剪碎大鼠樣本的暴露股骨(即大鼠左后肢股骨干骺端)，以備免疫組化測(cè)試骨樣本骨組織中TRPV5蛋白的表達(dá)。