1引言

嗜鹽菌指能在高鹽環(huán)境下生長的微生物，它主要生長在鹽湖、死海、鹽場等濃縮海水中以及一些鹽制品中。而來源于最適鹽濃度超過2.5mol/L嗜鹽菌中的蛋白稱為嗜鹽蛋白。這些蛋白成為目前研究其穩(wěn)定性機制的主要模式蛋白[1]。嗜鹽蛋白嗜鹽機理引起了眾多研究者的關(guān)注，目前認為主要有以下一些原因[2]：1.鹽橋，嗜鹽蛋白表面引入了酸性氨基酸(Asp、Glu)殘基，與堿性氨基酸(Lys、Arg)殘基形成鹽橋(saltbridge)，消除鹽離子的屏蔽效應(yīng)，使分子結(jié)構(gòu)具有剛性；2.溶劑可接觸表面，嗜鹽蛋白通過減少接觸表面從而有利于保持折疊，而酸性氨基酸的增加和lys的減少正好有利于這一變化。上述特點均和蛋白分子中氨基酸組成有關(guān)。顯然，嗜鹽蛋白在氨基酸使用上與其同源的非嗜鹽蛋白存在明顯差異。然而，目前尚未見有關(guān)嗜鹽蛋白質(zhì)中氨基酸使用偏好與其理化性質(zhì)之間聯(lián)系的研究，而這在嗜熱[3]、嗜冷[4]等極端蛋白質(zhì)中卻得到較深入研究。近年來，幾種嗜鹽微生物全基因組及蛋白質(zhì)組注釋的完成為本研究提供了可能。本文統(tǒng)計了362對嗜鹽及非嗜鹽同源蛋白，對其分別進行兩兩比對，通過統(tǒng)計同源位點氨基酸取代的情況，計算出20種氨基酸的嗜鹽不對稱指數(shù)，并同其243種物理化學(xué)性質(zhì)的進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其中存在明顯相關(guān)性的理化性質(zhì)，為研究嗜鹽蛋白穩(wěn)定性機制提供了新視角，報道如下。

2材料與方法

2.1數(shù)據(jù)來源

選取了極端嗜鹽細菌Salinibacterruber及與其在進化上比較接近的非嗜鹽菌Pelodictyonluteolum的全蛋白質(zhì)組序列，這兩種菌基因組GC含量也接近，也避免了由于基因組GC含量差異導(dǎo)致氨基酸使用偏向性。這些序列來源于Uniprot數(shù)據(jù)庫[5]，分別得到6078及2080條蛋白質(zhì)序列。

2.2同源序列的獲取及序列比對

為了減少信息冗余，剔除了所得序列中所有長度小于100個氨基酸的序列，因為它們大多為片斷（fragment）或者部分（partial），同時也剔除了其中注釋為膜蛋白的序列。同源序列（orthologs）的選取用BlastP程序，E值為1.0×10-10，找出90%長度覆蓋范圍內(nèi)，同一性（identity）大于30%的同源蛋白序列。最后共得到362對同源序列。該樣本量足夠用于探測嗜鹽蛋白在氨基酸使用上的某種趨勢。獲得同源序列后，將這362對同源蛋白兩兩進行比對，以統(tǒng)計同源蛋白在某些位點氨基酸發(fā)生突變的情況，進行比對的軟件為ClustalX。本文共統(tǒng)計了108701個氨基酸，其中52102個氨基酸在相應(yīng)位點發(fā)生了突變。

2.3嗜鹽不對稱指數(shù)的計算

在正常情況下，兩種氨基酸發(fā)生互相突變的幾率應(yīng)該是50:50的比例，即各占50%的幾率。若受到某種因素影響，就會偏離這種幾率，偏離程度越大，表明該因素的影響越大。嗜鹽不對稱指數(shù)（Halophilicasymmetryindex，HAI）就是基于這種理念進行計算的。本文采用JohnH.McDonald等計算嗜熱不對稱指數(shù)的方法。修訂后的計算公式為：ln(/)(1)ABBAABQQ=HAIhAI式中，A表示非嗜鹽蛋白中某位點的氨基酸，B表示嗜鹽蛋白質(zhì)對應(yīng)位點的氨基酸，ABQ表示非嗜鹽蛋白中氨基酸A出現(xiàn)的位點在嗜鹽蛋白相應(yīng)位點被B氨基酸取代的比例，BAQ的意思則相反。具體計算過程詳見文獻[6,7]。最近，McDonald對該算法進行了修訂，將指數(shù)值的中點數(shù)從1改為0，他認為這能更敏感的反應(yīng)數(shù)據(jù)的特性[6]。

2.4氨基酸理化性質(zhì)及相關(guān)性分析

文中使用了243種氨基酸的理化性質(zhì)，如：親疏水性、極性、分子量、等電點、分子表面可及性、分子體積、熱容、吉布斯自由能、形成各種二級結(jié)構(gòu)的傾向性、電荷分布、側(cè)鏈相互作用參數(shù)、平均柔性指數(shù)、長距離相互作用、范德華體積、熵、非共價鍵自由能等。這些數(shù)據(jù)來源于APDbase數(shù)據(jù)庫[8],網(wǎng)址為：http://www.rfdn.org/bioinfo/APDbase/index.html。將計算所得20種氨基酸的嗜鹽不對稱指數(shù)同上述243種理化性質(zhì)分別進行相關(guān)性分析，選取相關(guān)系數(shù)較大（大于0.5），顯著性較高（小于0.05）的理化性質(zhì)進行分析。

3結(jié)果與分析

3.1嗜鹽環(huán)境對氨基酸使用偏好的影響

通過統(tǒng)計嗜鹽及非嗜鹽同源蛋白在相應(yīng)位點某種氨基酸突變的總趨勢，可得到一個完整的兩種類型蛋白中氨基酸使用偏性的模式，從而看出嗜鹽環(huán)境對氨基酸使用偏好的影響，所得結(jié)果如表1所示。表中HAI值越大，表明該氨基酸更容易出現(xiàn)在嗜鹽蛋白中，其嗜鹽性能越強。例如：非嗜鹽蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19種氨基酸向嗜鹽蛋白中Asp突變的總數(shù)量為2246個，而嗜鹽蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19種氨基酸向非嗜鹽蛋白中Asp突變的總數(shù)量為4515個，這說明Asp更容易出現(xiàn)在嗜鹽蛋白中，因此，其嗜鹽不對稱指數(shù)（HAI）最大，為0.835，其嗜鹽性能也最強。其次分別為Glu（谷氨酸，E）、Pro（脯氨酸，P）及Gln（谷氨酰胺，Q）。而Phe（苯丙氨酸，F(xiàn)）、Met（甲硫氨酸，M）、Lys（賴氨酸，K）及Ile（異亮氨酸，I）則為最不嗜鹽氨基酸，其HAI值從-0.512到-0.685不等。Asp和Glu為酸性氨基酸，在正常生理條件下帶負電，而Lys為堿性氨基酸，在正常生理條件下帶正電，前者在嗜鹽蛋白中含量更高，而后者則更低[9]。因此，Asp和Glu的HAI值大，而Lys的HAI值則很小。Phe和Met非常容易形成β-折疊，而較多的β-折疊對于嗜鹽蛋白的穩(wěn)定性有不利影響，因此，這兩個氨基酸的HAI值也較小。然而，Pro的剛性較強，過多的Pro容易導(dǎo)致蛋白分子剛性太強，不利于其穩(wěn)定性[10]，同時，Pro很容易出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角和無規(guī)則轉(zhuǎn)曲中，是強烈的轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)曲形成子；而較多轉(zhuǎn)角或無規(guī)則轉(zhuǎn)曲會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更柔性，從而增加其穩(wěn)定性[11]。可能在嗜鹽蛋白中Pro主要是通過后一種機制增強嗜鹽蛋白的穩(wěn)定性。與此同時，雖然Ile的側(cè)鏈為分支的異丙基，能更有效提高蛋白分子表面的柔性，增加其穩(wěn)定性[12]，但是，Ile也同時強烈的β-折疊形成子，過多的β-折疊會導(dǎo)致嗜鹽蛋白不穩(wěn)定，因此，其HAI最小，嗜鹽性能最低。

3.2氨基酸嗜鹽不對稱指數(shù)與其理化性質(zhì)相關(guān)性分析