本文作者：張路遙 牛婉婷 楊昊 潘敏 單位：浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程

量子點(diǎn)(quantumdots,QDs)是一種熒光半導(dǎo)體納米晶體,直徑1~100nm。量子點(diǎn)主要由Ⅱ~Ⅵ族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ~Ⅳ族元素(如InP、InAs等)組成,目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究常用的水溶性量子點(diǎn)主要是CdX(X=S、Se、Te)[1]。由于量子限域效應(yīng)量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)特性:耐光漂白、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄且隨粒徑大小的改變而改變。所以,不同粒徑的量子點(diǎn)可以在同一激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)射不同顏色的熒光,有望解決傳統(tǒng)染料在復(fù)色檢測(cè)中存在的光譜覆蓋、不能同時(shí)激發(fā)等問題。1996年,Alivisatos[2]解決了量子點(diǎn)作為生物探針與生物分子之間的相容性問題,實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。1998年,Chan等[3]實(shí)驗(yàn)證明量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物有傳統(tǒng)熒光染料20倍的亮度、100倍的抗光漂白能力、1/3的發(fā)射半峰寬,從此,量子點(diǎn)成了最有前途的熒光標(biāo)記物之一。經(jīng)過修飾的水溶性量子點(diǎn),表面可與多種生物分子結(jié)合,從而獲得功能基團(tuán);基于量子點(diǎn)的探針和檢測(cè)系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)中;量子點(diǎn)的表面敏感特性在檢驗(yàn)中也得到了應(yīng)用[4,5];在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù)中量子點(diǎn)作為供體也顯示了傳統(tǒng)熒光染料所沒有的優(yōu)點(diǎn);量子點(diǎn)在各種新技術(shù)中的應(yīng)用更顯示了其巨大的潛力。本文將全面綜述經(jīng)過修飾的量子點(diǎn)在各方面的應(yīng)用現(xiàn)狀。

1量子點(diǎn)探針的應(yīng)用

經(jīng)過修飾的水溶性量子點(diǎn)具有免疫活性[3]和高度的特異性[6],可以作為熒光探針應(yīng)用于熒光免疫分析。偶聯(lián)了抗體的量子點(diǎn)探針可用于檢測(cè)抗原或細(xì)菌、腫瘤等有表面抗原的病原體、細(xì)胞、組織,并且具有很高的靈敏度。另外,量子點(diǎn)對(duì)表面變化非常敏感,基于量子點(diǎn)的這一特性發(fā)展起來的熒光猝滅探針、酶活性探針也具有很好的實(shí)用價(jià)值。

1.1量子點(diǎn)熒光免疫探針用于抗原檢測(cè)

Azzazy等[7]用親和素量子點(diǎn)探針對(duì)生物素化的前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,PSA)進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)限低達(dá)0.38pg/ml。Ker-man等[8]改進(jìn)了探針制備技術(shù),將量子點(diǎn)與單克隆抗體通過親和素-生物素偶聯(lián)制成探針,從而可以利用雙抗夾心免疫法直接對(duì)人血清標(biāo)本中的PSA進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)限可達(dá)0.25ng/ml,線性范圍為0•25~100ng/ml。

1.2量子點(diǎn)熒光免疫探針用于細(xì)菌檢測(cè)

Hahn等[9]報(bào)道了一種用量子點(diǎn)免疫探針檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)技術(shù)。他們用鏈霉親和素修飾的CdSe/ZnS核殼式量子點(diǎn)和生物素化的抗體偶聯(lián),這種探針可以特異性地識(shí)別大腸桿菌O157∶H7,檢測(cè)限達(dá)2•08×107cfu/ml,比傳統(tǒng)異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)靈敏度更高、穩(wěn)定性更好。Yang等[10]利用不同顏色的量子點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)了兩種病原菌:大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium。發(fā)射波長(zhǎng)分別為525nm和705nm的兩種量子點(diǎn)分別偶聯(lián)大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium的抗體。該方法能特異性識(shí)別并定量檢測(cè)混合體中相應(yīng)的細(xì)菌,檢測(cè)限為1×104cfu/ml。

1.3量子點(diǎn)熒光免疫探針用于腫瘤檢測(cè)

Hu等[11]用PEG修飾的CdSe量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)記物-癌胚抗原(carcinoembryonican-tigen,CEA)的檢測(cè)。PEG量子點(diǎn)通過靜電吸附偶聯(lián)CEA抗體rch24。這種探針能比傳統(tǒng)的FITC標(biāo)記更有效地檢測(cè)LS180細(xì)胞系表面表達(dá)的CEA。Yu等[12]用CdSe/ZnS量子點(diǎn)偶聯(lián)鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)抗體來識(shí)別肝癌標(biāo)記物AFP,量子點(diǎn)-AFP抗體探針通過尾靜脈注射到小鼠內(nèi)。點(diǎn)對(duì)點(diǎn)激光照射獲取腫瘤部位和正常組織的熒光信號(hào):熒光主要分布在肝癌組織上,周圍組織的熒光強(qiáng)度迅速下降,基本無非特異性分布。

1.4量子點(diǎn)熒光探針猝滅的應(yīng)用

量子點(diǎn)表面修飾有生物活性的酶之后,基于量子點(diǎn)對(duì)表面敏感的特性,可以用于檢測(cè)酶底物的濃度。Ji等[13]報(bào)道了一種新穎的基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)-有機(jī)磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)探針的生物傳感器。其熒光猝滅程度和有機(jī)磷的濃度成線性相關(guān),檢測(cè)限可達(dá)10-8mol/L。增大OPH和量子點(diǎn)的比例能夠增加傳感器的靈敏度,但是當(dāng)量子點(diǎn)表面結(jié)合的OPH已經(jīng)飽和后,探針靈敏度不再增加。該方法為有機(jī)磷的檢測(cè)提供了新途徑,極具實(shí)用價(jià)值。

2量子點(diǎn)FRET在檢測(cè)中的應(yīng)用

FRET是一項(xiàng)應(yīng)用能量轉(zhuǎn)移來測(cè)量分子級(jí)別的距離的技術(shù)。當(dāng)供體發(fā)射的熒光與受體的吸收光譜重疊,并且供受體之間的距離很近(<10nm)時(shí),供體受激發(fā)產(chǎn)生的偶極子震蕩就會(huì)引起受體偶極子的共振,發(fā)生這種非放射性的能量轉(zhuǎn)移[14]。FRET對(duì)供受體間的距離非常敏感[15],可以用來檢測(cè)蛋白質(zhì)、核酸的分子結(jié)構(gòu)和距離的微小變化。量子點(diǎn)作為FRET供體相對(duì)于有機(jī)熒光染料在靈敏度方面有很大的優(yōu)勢(shì):量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬,可以選擇產(chǎn)生背景熒光少的激發(fā)波長(zhǎng)段來進(jìn)行檢測(cè),量子點(diǎn)-有機(jī)染料-FRET探針可產(chǎn)生相對(duì)背景熒光更顯著的熒光信號(hào),從而能夠檢測(cè)到較低濃度的目標(biāo),并且多余的探針并不影響檢測(cè)效果,操作起來更為方便。

2.1量子點(diǎn)FRET在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用

基于量子點(diǎn)檢測(cè)DNA的方法很多,大部分量子點(diǎn)DNA探針是用量子點(diǎn)作為供體、有機(jī)染料作為受體的。Zhang等[16]介紹了一種超靈敏的、基于量子點(diǎn)熒光共振轉(zhuǎn)移的DNA檢測(cè)方法。該方法可以用于檢測(cè)未分離的低濃度DNA。量子點(diǎn)修飾一段DNA單鏈,有機(jī)染料Cy5標(biāo)記另一段DNA單鏈,Cy5作為受體,量子點(diǎn)作為供體,二者與目標(biāo)DNA結(jié)合,從而發(fā)生FRET。與同樣用FRET技術(shù)的分子信標(biāo)法相比,量子點(diǎn)作為供體背景熒光更少,靈敏度更高(4•8fmol/L),目前已成功檢測(cè)基因點(diǎn)突變。

2.2量子點(diǎn)FRET在蛋白濃度和酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用

Ma等[17]發(fā)現(xiàn)FRET可以用于檢測(cè)溶液中鼠源IgG的含量。紅綠兩種不同顏色的量子點(diǎn)先后加入到IgG溶液中與IgG通過靜電結(jié)合后可以觀測(cè)到FRET現(xiàn)象的發(fā)生。FRET增強(qiáng)的程度和IgG濃度成線性相關(guān),線性范圍在0•1~20•0mg/L。在此FRET體系中加入木瓜蛋白酶后,IgG酶解,兩種量子點(diǎn)之間的距離增大,FRET也隨之消失。從另一個(gè)角度考慮,FRET也可以用于酶的活性檢測(cè)。基于這一原理,Xu等[18]將Cy5-底物-量子點(diǎn)FRET探針用于β-內(nèi)酰胺酶的活性的檢驗(yàn),檢測(cè)限32μg/ml。這種酶是細(xì)菌產(chǎn)生的,其活性與細(xì)菌的抗藥性相關(guān),在檢驗(yàn)β-內(nèi)酰胺類抗生素藥效方面具有很重要的臨床意義。

3量子點(diǎn)在新技術(shù)中的應(yīng)用