蛋白質(zhì)的體外消化模型

蛋白質(zhì)是食品的重要成分之一，涉及到的蛋白質(zhì)消化酶及消化條件有比較好的研究基礎(chǔ)，且相對(duì)明確，因此，針對(duì)蛋白質(zhì)的體外消化模型研究的最早，相關(guān)的研究和應(yīng)用報(bào)道也較多。

1.蛋白質(zhì)體外消化模型建立的主要依據(jù)

消化蛋白質(zhì)的酶主要是蛋白酶，食物經(jīng)過(guò)口腔的咀嚼，經(jīng)由咽、食管、進(jìn)入胃、小腸中，在蛋白酶比較豐富的胃腸開始消化過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)中酶的濃度、反應(yīng)溫度、pH、時(shí)間及抑制劑、激活劑都是影響蛋白質(zhì)消化的重要因素，且消化不同食物來(lái)源的蛋白質(zhì)的酶種類不同，它們刺激腸胃產(chǎn)生的酶量不同、所需消化時(shí)間也不同。在模擬消化的過(guò)程中，一般模擬的部位主要是胃和小腸，在胃中水解蛋白質(zhì)的胃液主要由胃蛋白酶和胃酸組成。小腸中的蛋白質(zhì)消化相對(duì)復(fù)雜，由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和肽酶、羧肽酶 A、B 等組成，可將經(jīng)胃消化所得的肽或蛋白質(zhì)進(jìn)一步水解為氨基酸和小肽。蛋白質(zhì)體外消化模型一般以蛋白質(zhì)的消化率為測(cè)定參數(shù)，消化率是動(dòng)物從食物中所消化吸收的蛋白質(zhì)占總攝入量的百分比，是評(píng)價(jià)食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。Abdel-Aal[6]研究表明，蛋白酶的種類及酶作用順序和過(guò)程會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的消化率產(chǎn)生影響。他們用三種酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶）同時(shí)消化蛋白質(zhì)，對(duì)比兩種酶（胃蛋白酶和胰液素）分兩步消化蛋白質(zhì)，就蛋白質(zhì)的消化率而言，發(fā)現(xiàn)前者比后者高 39-66%。席鵬彬等[7]在研究菜粕的體外消化中也發(fā)現(xiàn)，如果用胰酶制劑代替胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解過(guò)程中的胰蛋白酶可使菜粕干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的消化率分別提高 5.2%和 11%。所以，復(fù)合酶體系更符合體內(nèi)的消化狀況[1]。另外，攝食的蛋白量增大會(huì)引起胰液素蛋白酶的分泌增多，同樣地，淀粉和脂質(zhì)的攝入量增加會(huì)分別引起唾液淀粉酶和酯酶分泌增多，即食物組成和攝入量的不同會(huì)引起相應(yīng)的酶分泌增加或減少，建立體外消化模型時(shí)也需考慮這方面的因素。單酶法可用來(lái)預(yù)測(cè)單個(gè)物質(zhì)的可消化性，例如，淀粉的消化主要用淀粉酶，脂質(zhì)的消化主要用脂肪酶、蛋白質(zhì)消化用蛋白酶[1]。單酶消化法要比運(yùn)用復(fù)合酶消化更有利于消化模型的標(biāo)準(zhǔn)化，但實(shí)際上，食用物質(zhì)中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相互作用，彼此間相互影響，所以就實(shí)用性而言，復(fù)合酶體系占優(yōu)勢(shì)[2]。

2.體外消化模型在食物蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

近十年來(lái)被用于蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)代謝、生理活性、過(guò)敏原檢測(cè)等方面研究的體外消化模型中，主要以谷物類蛋白，奶制品中的蛋白質(zhì)，以及水產(chǎn)品和一些果蔬中的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象。谷物類作為人們食物的主要來(lái)源，其蛋白質(zhì)是主要研究對(duì)象，如對(duì)小麥蛋白[6]、大豆蛋白[8]、菜粕粗蛋白[9]等都有研究。在這些體外消化模型中，所采用的消化酶主要是胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰液素，牛奶作為膳食中蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一也是蛋白質(zhì)體外消化模型的主要研究對(duì)象，如對(duì)牛奶蛋白[10]、山羊奶蛋白[11]、牛乳清蛋白[12]、瑞士干酪[13]、β-乳球蛋白[14]的研究。上述體外消化模型因研究對(duì)象和目的不同，采用的消化酶組成和 pH 也不盡相同。例如在研究牛乳清蛋白時(shí)，研究者首先模擬胃部消化環(huán)境，在體外采用豬胃蛋白酶、牛科動(dòng)物的凝乳蛋白酶、胃蛋白酶以及不同 pH 的小鼠胃液對(duì)牛乳清蛋白進(jìn)行消化，結(jié)果表明在不同消化酶的作用下 α-乳白蛋白和牛血清白蛋白被水解了而 β-乳球蛋白在不同的消化酶和不同 pH 作用下都沒能水解，可見加熱變性的乳清蛋白包括 β-乳球蛋白都被胃蛋白酶徹底水解了。在進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)了與體外試驗(yàn)相同的結(jié)果，天然的 β-乳球蛋白在小鼠體內(nèi)未能消化但是加熱變性的 β-乳球蛋白卻在小鼠胃內(nèi)消化了，與胃部體外模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。接著，研究者在體外模型和小鼠體內(nèi)分別研究蛋白質(zhì)在腸中的消化，在體外用胰液素去消化天然的和變性的 β-乳球蛋白，二者都被消化了，同時(shí)將在胃中不消化的天然的 β-乳球蛋白注射到小鼠胃內(nèi)，這些天然的β-乳球蛋白進(jìn)入小腸后也被消化了，這與體外結(jié)果也是一致的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明體外建立模型模擬蛋白質(zhì)的消化可以較好的反應(yīng)體內(nèi)真實(shí)的消化狀況，將其作為蛋白質(zhì)消化研究的方法和工具是可行的。

3.體外消化模型在活性寡肽研究中的應(yīng)用

隨著生物活性寡肽研究的深入，關(guān)于活性肽的消化研究也逐步展開。攝入蛋白質(zhì)不僅是人體需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氨基酸的重要來(lái)源，還扮演著生物活性肽的重要角色，體外模型對(duì)活性肽消化和活性的評(píng)價(jià)已有應(yīng)用的先例。目前報(bào)道較多的是消化模型應(yīng)用于 ACE 酶抑制活性肽的研究。有研究者在體外用 pH 在 2～3 之間的胃蛋白酶液和 pH 在 7～8 之間的胰液素消化瑞士干酪[15]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化后的蛋白產(chǎn)物的 ACE酶抑制活性發(fā)生了變化。高分子量的蛋白質(zhì)消化后會(huì)產(chǎn)生一些新的活性肽，加強(qiáng)對(duì) ACE 酶的抑制，而原本具有一定 ACE 酶抑制作用的 10ku 的肽卻被消化了，這又降低了產(chǎn)物的 ACE 酶抑制活性，研究結(jié)果表明消化帶來(lái)的蛋白和肽的結(jié)構(gòu)變化，將與其體外活性測(cè)定的結(jié)果有所差別，高活性的物質(zhì)也許經(jīng)過(guò)消化后，其活性中心被影響，導(dǎo)致活性降低，而低活性的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)消化后也許活性片段將暴露，活性反而更高。因此，傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單的體外活性篩選不能完全反應(yīng)它們?cè)隗w內(nèi)經(jīng)消化后的活性狀況，結(jié)合消化模型對(duì)活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)是十分必要的。同類研究還有用胃蛋白酶-胰液素聯(lián)合消化大豆蛋白[10]或鰹魚[16]蛋白，研究其產(chǎn)物的 ACE 酶抑制活性。體外消化模型也有用于抗氧化肽研究的報(bào)道，我國(guó)學(xué)者王興等[17]人通過(guò)體外模擬部分胃、腸道消化過(guò)程，考察苦蕎蛋白經(jīng)胃、腸道消化后生成肽的組成及其抗氧化活性，揭示了苦蕎蛋白質(zhì)體內(nèi)消化與抗氧化活性的關(guān)系。研究結(jié)果顯示苦蕎蛋白質(zhì)經(jīng)模擬消化 10h 后產(chǎn)生最高抗氧化活性多肽，凝膠分離出 5 個(gè)組分，其中分子質(zhì)量為 900u 的肽具有最強(qiáng)的抗氧化活性。生物活性肽在人體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，活性肽進(jìn)入人體后的消化產(chǎn)物是多樣的，只有能在體內(nèi)環(huán)境下保留某些特征結(jié)構(gòu)或者釋放特征結(jié)構(gòu)的肽分子才會(huì)在人體內(nèi)發(fā)揮重要功能。因而，采用體外消化模型進(jìn)行活性肽的篩選和評(píng)價(jià)，不僅可以縮短研究時(shí)間，減少研究費(fèi)用，同時(shí)也是更為準(zhǔn)確和合理評(píng)價(jià)其活性所必需的，對(duì)于生物活性肽食品、藥品的開發(fā)有重要意義。

4.體外消化模型在過(guò)敏原研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)體外消化模型還被應(yīng)用于過(guò)敏原等對(duì)人體有重大潛在危害的蛋白或肽類物質(zhì)的檢測(cè)中。如對(duì)獼猴桃過(guò)敏原[18]、鯉魚過(guò)敏原[16]的研究。一些研究者通過(guò)模擬腸胃液消化試驗(yàn)，分析鋸緣青蟹肌肉中過(guò)敏原（原肌球蛋白）的消化特性以及消化對(duì)過(guò)敏蛋白致敏性的影響，結(jié)果表明蟹類過(guò)敏蛋白相對(duì)于非過(guò)敏蛋白具有較高的消化穩(wěn)定性，而且其高分子質(zhì)量降解產(chǎn)物仍可能引起過(guò)敏反應(yīng)[19]。試驗(yàn)采用模擬胃、腸液環(huán)境，以 SDS-PAGE 和Westernblot 進(jìn)行分析，對(duì)青蟹原肌球蛋白和肌原纖維蛋白在體外模擬腸胃環(huán)境中的消化穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定。在模擬胃液反應(yīng)中，非過(guò)敏原蛋白尤其是肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白可被胃蛋白酶快速降解，而過(guò)敏原蛋白原肌球蛋白在 60min 時(shí)仍未被完全分解。在模擬腸液反應(yīng)中，相對(duì)于致敏蛋白，肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白等非過(guò)敏蛋白在較短的時(shí)間內(nèi)被分解，原肌球蛋白盡管 120min 后幾乎被完全分解，但會(huì)產(chǎn)生一些較穩(wěn)定的蛋白降解片段，而且其中一些分子質(zhì)量為 34ku 的原肌球蛋白降解產(chǎn)物仍具有過(guò)敏原性。體外模型的應(yīng)用為過(guò)敏原的研究提供了簡(jiǎn)便實(shí)用的工具。除上述研究外，還有大量的應(yīng)用體外消化模型對(duì)動(dòng)植物蛋白進(jìn)行研究的報(bào)道，如對(duì)海藻蛋白[20]、肌原纖維蛋白[21]、肉類蛋白[22]、抗高血壓三肽[23]以及其它動(dòng)物副產(chǎn)品蛋白的研究。由此可見，作為應(yīng)用較早的體外消化模型，蛋白質(zhì)體外消化模型已經(jīng)開始在蛋白質(zhì)的各類研究中發(fā)揮重要作用。