材料與方法

1.材料與試劑:

新西蘭無水奶油(上海愛普香精香料有限公司)；Palatase20,000L（丹麥諾維信公司）；0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(食品級)；0.1mol/L氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）；95%乙醇（分析純）；石油醚（分析純）；酚酞；氫氧化鈉-乙醇溶液（分析純）；0.5mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）；中性乙醇（自制）；去離子水（自制）。

2.儀器與設(shè)備:ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JB90-SH型數(shù)顯恒速強力電動攪拌機，上海標(biāo)本模型廠；DHG-9073B5-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

3.試驗方法

原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的測定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法GB5511-2008；水分的測定：干燥法GB5497-1985；灰分的測定：馬福爐灼燒法GB5009.4-2010；過氧化值的測定：碘量法GB5538-2005；酸價的測定：滴定法GB5530-2005。

酶解產(chǎn)物的制備及處理:取150g無水奶油于0.2mol/L磷酸緩沖液中，將此混合物置于三角瓶中，加入0.25%的酶在50℃、以170r/min攪拌下進行酶解反應(yīng)，分別在2小時、4小時、6小時、8小時、10小時取適量的反應(yīng)物測定其酸價和皂化價，以脂解率為評價指標(biāo)，在各個不同反應(yīng)階段，研究不同的酶添加量、底物濃度、酶解時間及pH對酶解產(chǎn)物的影響。

脂解率的測定:測定酶解反應(yīng)混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV），根據(jù)公式（1-1）來計算脂解率：脂解率%=反應(yīng)前后酸價變化含量/反應(yīng)后的皂化值×100（1-1）式中：皂化值的測定[17]：約稱量2g酶解產(chǎn)物加入到25ml氫氧化鈉-乙醇溶液于錐形瓶中，接上回流冷凝管，在恒溫85℃的水浴鍋中煮沸約30分鐘，待煮液透明后，取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向錐形瓶中滴加酚酞數(shù)滴，趁熱用鹽酸滴定紅色消失。

4.奶油酶解工藝條件優(yōu)化

單因素實驗結(jié)果表明，當(dāng)加酶量為底物干重的0.25%時與0.3%時基本保持水平，這時的脂解率不再隨加酶量的增加而增加，同時考慮到生產(chǎn)工業(yè)化的成本，因此選擇底物干重的0.25%作為酶添加量。同時隨著酶解時間的增長，脂解率也會不斷的增大，但酶解的目的不在追求脂解率的最大化，而在于能得到風(fēng)味最佳的酶解基料，同時在單因素反應(yīng)系列中不難發(fā)現(xiàn)，酶解反應(yīng)到最后幾個小時，脂解率基本保持一致，不再隨反應(yīng)時間增長而增大。此外，若酶解時間過長會導(dǎo)致長鏈脂肪酸釋放過多，以至于基料帶有明顯的皂味；若酶解時間過短必會影響到中短鏈脂肪酸的釋放，導(dǎo)致基料風(fēng)味有缺陷，增香強度不夠[18]，所以初步選定酶解時間為6小時，以底物濃度、酶解溫度和pH值3個因素作為自變量，并以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以脂解率為響應(yīng)值，利用Design-Expert7.0設(shè)計三因素三水平試驗方案，建立二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法來確定最佳的酶解條件。

結(jié)果與討論

1.原料奶油基本成分:酶法制備奶味香精基料可以選擇多種原料，不同奶油原料有著不同的風(fēng)味特點，為制得氣味自然，滋味濃厚感突出的增香產(chǎn)物，除了乳脂肪外還需要適量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物質(zhì)。原料奶油基本成分見表1。

2.單因素試驗結(jié)果

酶添加量對脂解率影響:在反應(yīng)體系總量150g不變的條件下，固定奶油底物和緩沖液的相對質(zhì)量比為85%，反應(yīng)溫度為50℃，pH為8，分別考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）對脂解率的影響，并且分別在2小時、4小時、6小時、8小時和10小時取樣分析不同酶解時間對整個反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果表明，隨著加酶量的增加，脂肪酶Palatase20,000L對無水奶油的酶解作用逐漸增強，當(dāng)加酶量超過0.25%底物干重時，脂解率增加趨勢變緩，說明酶已經(jīng)達(dá)到飽和濃度，而且反應(yīng)在6-10小時這個間段與0.3%底物干重時反應(yīng)體系幾乎重疊，說明當(dāng)反應(yīng)時間大于6小時，脂解率變化不明顯，繼續(xù)增加酶濃度及反應(yīng)時間對酶解率的影響不大，所以選擇最適酶添加量為0.25%底物干重。

底物濃度對脂解率的影響:脂肪酶在油水界面上具有較大的活性，因此催化作用需要有一定的水分來維持酶分子的活性構(gòu)象，同時改變其分子構(gòu)象暴露活性中心，使酶處于激活狀態(tài)而表現(xiàn)一定的催化能力。當(dāng)水分含量過低或過高時，酶分子的催化部位就不能和水分子緊密接觸，進而不能很好的維持酶的活性分子構(gòu)象，導(dǎo)致酶解能力降低[19]，因此，油脂水解需要一個適宜的底物濃度，為此本實驗在保持反應(yīng)總量不變的條件下，改變無水奶油與磷酸鹽緩沖液的相對質(zhì)量比來觀察底物濃度對脂解率的影響，分別選擇75%、80%、85%、90%、95%五個底物濃度，并且在不同時間段分析酶解時間對脂解率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，底物濃度對脂解率影響是明顯的，在濃度處于75%到85%之間時脂解率迅速增大，而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^85%后脂解變化開始變緩，從90%上升到95%時脂解率反而呈減少趨勢，由于脂肪酶活性僅需少量水就可以保持酶的活性，因此只要能夠滿足酶的活性，脂解率就會隨底物濃度增大而增大，若底物濃度過大，則會產(chǎn)生底物對酶解反應(yīng)有抑制作用，因此水解乳脂肪的最適底物濃度為85%。

pH對脂解率的影響:不同的pH值會影響到酶分子活性中心的催化基團的穩(wěn)定性，進而影響整個反應(yīng)體系的酶解速率，在固定酶添加量、底物濃度、溫度及不同反應(yīng)時間段，調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液的pH值來觀察不同pH值對脂解率的影響，結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明，在相同的實驗條件下，當(dāng)pH為8時，奶油酶解的速率是最高的，在各個不用的時間段也是在pH為8時最高，因此脂肪酶Palatase20,000L在pH為8時酶解活性最強，為此最適反應(yīng)pH為8。

溫度對脂解率的影響：不同的溫度會影響到脂肪酶活性中心的分子構(gòu)象分布及底物奶油的乳化狀態(tài)，進而影響到整個反應(yīng)的酶解速率，在溫度低于最適溫度時，酶活性較低，則反應(yīng)速度較慢；當(dāng)溫度高于最適溫度時會導(dǎo)致脂肪酶變性而減弱甚至失去催化活性，本試驗選擇5個溫度條件，固定底物濃度、酶添加量及pH值在不同時間點分別取樣來分析不同溫度對脂解率的影響。結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出溫度對脂肪酶Palatase20,000L影響是很明顯的，當(dāng)溫度從40℃升高到50℃時脂解率是明顯增大，而溫度升高到50℃后脂解率就出現(xiàn)變緩趨勢，處于50℃與55℃之間時達(dá)到最大值，但當(dāng)繼續(xù)升高溫度時脂解率是明顯下降，說明脂肪酶已逐步變性失活，同時隨著反應(yīng)時間的延長底物量不斷減少，酶活力的下降，從反應(yīng)6小時后，脂解率的增加已趨于平緩，在6、8、10小時這時間段反應(yīng)速率曲線趨于重疊。因此脂肪酶Palatase20,000L的最適酶解溫度在50℃左右。