藏酋猴Macacathibetana隸屬哺乳綱Mammalia靈長目Primate獼猴屬Macaca，是我國特有物種。藏酋猴分布范圍廣，僅次于恒河猴，主要分布于四川、西藏東部、甘肅東南部、陜西南部、重慶、云南東北部、貴州、湖南、湖北西北部、廣西、廣東、江西、安徽、福建和浙江等地，是世界少數(shù)幾種自然分布區(qū)幾乎全部在北回歸線以北的靈長類物種(蔣學龍等，1996)，各種生理學特點與人相似，是一種理想的實驗動物(《四川資源動物志》編輯委員會，1984)。達菲抗原/趨化因子受體(DuffyAntigen/Rece-porforChemokines，DARC，又稱為Duffy，簡稱FY)編碼血紅細胞表面上的一個趨化因子受體，是7次跨膜的G蛋白非偶聯(lián)糖蛋白即達菲蛋白，是1950年Cutbush等在多次輸血溶血的病人血清中利用同種抗體首次檢測到的一種糖蛋白。根據(jù)FYmRNA剪并與否，可將Duffy多肽分為主要(336aa)和次要(338aa)的兩種形式(Toumamille，2000);該受體是已知的瘧原蟲Plasmodiumvivax的一個結(jié)合點(Tungetal.，2009)。近年來，隨著免疫學和分子生物學技術(shù)更新進步，對達菲蛋白的研究更加深入。2004年起相繼報道:增強內(nèi)皮細胞mDuffy的表達能使受損血管生成、維護內(nèi)穩(wěn)態(tài)及應(yīng)激能力增強(Tournamilleetal.，2004);缺乏Duffy的小鼠不能與CXC趨化因子結(jié)合而引起腫瘤病例增加(Lentsch，2006);乳腺癌病例人群樣品研究顯示，Duffy高表達的個體幾乎沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并且死亡率也很低(Wangetal.，2006)。可見Duffy的表達對機體的免疫起著至關(guān)重要的作用。2009年《Nature》發(fā)表:狒狒FY基因的功能性變異形式與在人類中所看到的變異形式不同源，并且狒狒FY基因的變異是瘧疾類寄生蟲“肝囊蟲”易感的一個關(guān)鍵決定因子(Tungetal.，2009)，再次引起更多人對達菲蛋白和瘧疾的關(guān)注。瘧疾一直是全球性的健康問題，約40%的人口生活在瘧疾流行地區(qū)，每年有幾百萬人死于此疾病(Muelleretal.，2009;Guerraetal.，2010)。間日瘧原蟲是引起人類瘧疾的瘧原蟲之一，達菲蛋白是間日瘧原蟲感染的受體。研究人員試圖研究一種切實可行的新方法，通過免疫結(jié)合反應(yīng)來預防和治療瘧疾。目前已明確人類FY基因定位、分布和部分生理學功能(趙書平，2001)，但對藏酋猴FY基因的生物學性質(zhì)未見有報道。鑒于藏酋猴的地域特點和與人的親緣關(guān)系，本研究對藏酋猴的FY基因進行克隆、序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)預測，為進一步探討該基因?qū)Ο懠驳念A防和治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

藏酋猴肌肉樣本采集于四川省雅安市碧峰峽野生動物園自然死亡個體，冷凍保存帶回實驗室，貯存于－80℃超低溫冰箱。PCR所需MasterMix酶和ddH2O均購自東盛公司;DNA凝膠純化試劑盒和引物合成由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2標本預處理

取保存的藏酋猴肌肉組織少許(約30～50mg)，放入1.5mL離心管中，加入0.9%生理鹽水100μL，剪碎組織塊;再加入700～800μL生理鹽水，放置24h，期間更換5次;將最后一次生理鹽水吸出后，加入10×TE800μL溶液，置換2次;最后將TE溶液吸干凈。

1.3基因組DNA提取

DNA的提取按常規(guī)酚-氯仿法進行(Sambrook，1989)。所提DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Green-View核酸染料染色，于紫外透射儀上觀察估計濃度和純度。

1.4引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中搜索出的FY基因序列，包括恒河猴(Macacamulatta，HQ285849.1)、人(Homosa-piens，NM_002036.2)、狨猴(Callithrixjaachus，XM_002760156.1)、大猩猩(Gorillagorilla，JN544134.2)、犬(Canisfamiliaris，XM_536127.3)、牛(Bostaurus，BC142464.1)相對保守序列，利用Primer5.0生物軟件設(shè)計2對特異性引物，序列如下:引物1:FY1-F:5'-CCTCATTAGTCCTTGGCTCTTATCT-3'FY1-R:5'-ACCATACCAGACACAGTAGCCCA-3'引物2:FY2-F:5'-CCTCAACTCAGAACTCAAGTCAGC-3'FY2-R:5'-TCTCCCCAGACAAAATAAGAAACC-3'

1.5PCR擴增

用設(shè)計的引物擴增FY基因，當模板DNA濃度為50ng/μL時，通過反復試驗，摸索配置了一套同時適用2對引物的有效擴增FY基因的PCR反應(yīng)體系:基因組DNA(50ng/μL)2.0μL，Primers(10μmol/L)各1.5μL，ddH2O25μL，MasterMix酶20μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預變性5min;94℃變性30s，61℃退火35s，72℃延伸45s，36個循環(huán);72℃延伸5min，4℃保存。取1μL的PCR產(chǎn)物，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)GreenView核酸染料染色，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測并拍照。之后采用DNA膠回收試劑盒對凝膠產(chǎn)物進行回收后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.6序列分析

所測序列用Chromosoma1.62，DNAStar軟件包中SeqMan、EditSeq、Megalign軟件進行人工校對和編輯，確保序列無誤。序列確定后，DNA序列的ORF查找和編碼預測分別采用ORFfinder軟件和GenScan軟件;序列的相似性比較采用Blast軟件;多序列的比較分析采用ClustalW軟件;繪制進化樹采用MEGA5.0;蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與特征預測采用Pre-dictProtein軟件;氨基酸序列疏水性分析采用DNA-MAN軟件;采用MEGA5.0軟件，計算序列間堿基對的差異、轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及其比值。進行數(shù)據(jù)分析時在GenBank中引用了6個物種的FY基因序列:人、恒河猴、牛、兔(Oryctolaguscuniculus，F(xiàn)J811765.1)、犬和大熊貓(Ailuropodamelanoleuca，XM_002927274.1)。

2結(jié)果

2.1測序結(jié)果和序列特性

根據(jù)恒河猴FY基因序列特點，采用2對引物分段進行擴增，中間重疊對接。經(jīng)PCR擴增后，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在DL2000marker近1～2kb間均有特異性的產(chǎn)物帶，與預期約1.1kb和1.2kb的產(chǎn)物相近，初步估計為所需產(chǎn)物。將PCR回收產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)人工校對、序列拼接，所得序列為1491bp。與GenBank中恒河猴的FY基因序列(HQ285849.1)比較后，確認本試驗所克隆序列是藏酋猴FY基因DNA序列，含有完整的2個外顯子，大小分別為21bp和990bp，兩外顯子之間有1內(nèi)含子，大小為480bp。該序列已提交到GenBank(登錄號為JQ037908)。藏酋猴的FY基因CDS序列和預測的氨基酸序列如圖1所示，ORF序列為1011bp，編碼336個氨基酸殘基，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TAG，A、T、G、C的平均含量分別為15.63%、26.14%、27.40%、30.56%，G+C含量較高，為57.96%，A+T含量為42.04%。對藏酋猴FY基因蛋白質(zhì)預測顯示，其分子量為35.52kDa，pI為5.77，在pH7.0時的帶電荷量為－4.95。該蛋白含有161個非極性氨基酸殘基(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸)和79個極性氨基酸殘基(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)，以及17個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)和11個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)。拓撲結(jié)構(gòu)預測如圖1所示，藏酋猴FY蛋白上有15個潛在的功能位點:3個N-糖基化位點(16NSSQ，27NFSY，33NDSF)，2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(35SFPD，327SHLD)，10個N-肉豆蔻酰化位點(72GILASG，119GLGNTR，138GSAFAQ，148GCHASL，160GQVPGL，168GLSVGL，189GASGGL，224GLFGAK，230GLKKAL，257GVVLGL)。整個蛋白質(zhì)多肽鏈含有7個跨膜螺旋區(qū)(位于64～83，92～116，135～154，163～187，208～227，234～253，284～307)，4個細胞外區(qū)(位于1～63，117～134，188～207，254～283)和4個細胞內(nèi)區(qū)(位于84～91，155～162，228～233，308～336)。人、恒河猴、牛和犬的達菲蛋白的功能位點見表。采用DNAMAN軟件按默認值參數(shù)對藏酋猴FY蛋白質(zhì)氨基酸序列進行疏水性分析，結(jié)果見圖2。由該圖譜可知，藏酋猴FY蛋白質(zhì)氨基酸序列的大部分區(qū)段都為疏水區(qū)，親水區(qū)段有23個，其中大的區(qū)段只有3個(位于8～26，28～44，322～336)，包含的氨基酸殘基數(shù)為15～19個，其余的均為小區(qū)段或點(位于4～6，52，56～57，60，87～88，91～93，119～125，152～153，156～158，190，199，201～202，204，206，229～231，234，238～241，254～255，280～281，309～312)，包含的氨基酸殘基數(shù)僅為1～7個，所有親水性氨基酸殘基數(shù)(97個)占總氨基酸殘基數(shù)(336個)的比例約28.87%。結(jié)合胞內(nèi)外所處位置，在23個親水區(qū)段中，除了87～88，156～158，229～231，309～312區(qū)段位于胞內(nèi)區(qū)域，91～93，152～153，238～241區(qū)段位于跨膜區(qū)域，其余各親水區(qū)段均位于胞外區(qū)域。進一步預測可知，該蛋白總平均疏水性(Grandaverageofhydropathicity，GRAVY)值為0.689，不穩(wěn)定系數(shù)是39.84，分子半衰期30h。這些結(jié)果表明，藏酋猴FY蛋白質(zhì)為疏水性蛋白，其親水性區(qū)段所占比例較小，但是主要位于胞外區(qū)域。